服务背景

实时荧光定量PCR技术是生命科学领域的一项重要技术，是快速检测基因表达水平的首选方法。qPCR实验步骤繁多，后续的数据处理工作也颇为复杂，一些科研工作者往往花费了很多的时间和精力却仍得不到满意的qPCR结果。

沃森生物可根据客户需求和实验目的，为您设计切实可行的实验方案，全程采用符合国际标准的进口试剂完成实验，提供给您一份客观翔实的实验报告及符合论文发表标准的图表。帮您完美解决qPCR实验过程中的一切问题，让您能不再为技术问题而烦恼，有更多的精力和时间聚焦科学问题！

实验原理

实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团(包括荧光染料或荧光标记的特异性探针)，对PCR产物进行标记跟踪，随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化，并结合相应软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，从而计算待测样品中目的基因初始模版的量，常用于分析目的基因的表达水平的变化。

服务内容

相对定量qPCR包括：

mRNA引物/探针设计以及表达检测服务

lncRNA引物/探针设计以及表达检测服务

miRNA引物/探针设计以及表达检测服务

circRNA引物/探针设计以及表达检测服务

对各类型样本中各种RNA差异表达相对定量。每个样本重复三次，我公司可提供常用内参基因引物。

实验流程

1、客户提供目标基因序列以及表达量等相关信息

2、根据目的基因序列设计并合成特异性引物/特异性TaqMan探针

3、抽提RNA，逆转录RT-PCR及cDNA扩增

4、PCR反应条件优化

5、qPCR样品正式上机分析（采用SYBR Green I法或TaqMan探针法两种方式）

6、数据分析（可根据客户要求制作相关图表；一般采用2-ΔΔ Ct法进行计算。）

绝对定量

需要制备标准品并建立标准曲线，然后检测目的样本中的基因，比对标准曲线得到基因准确拷贝数。常用于质粒拷贝数计算、DNA拷贝数分析等。

实验流程

1、客户提供基因序列以及相关信息

2、根据序列设计并合成引物

3、抽提RNA/DNA，扩增目的片段，连接载体，制备质粒标准品

4、建立标准品稀释梯度，上机分析，绘制标准曲线

5、根据标准曲线以及目的基因上机分析结果计算目的基因拷贝数

服务优势

检测内容覆盖全面，针对多类型RNA制定不同的实验方案

丰富的特殊样品项目经验（比如血液，石蜡组织等各类复杂特殊样本）

引物设计经验丰富，可根据客户需求和RNA种类设计高质量引物

进口高效染料搭配定量仪器，提供准确可靠的数据结果

实验结果报告翔实可靠，可根据客户需要绘制可用于发表的图表

服务流程

1、客户提供需要检测的基因名称、登录号或序列

2、确认客户样品数量、种属、样本类型

3、我司技术部根据客户提供的信息设计好实验方案，销售做出报价合同

4、客户确定无误后签订《沃森生物-qPCR检测服务合同》，并签字（或盖章）

5、支付项目预付款，服务正式启动

6、提供实验样品（细胞、组织、血液等）

7、技术员根据合同实验方案开展实验

8、实验结束后，发送初步实验报告

9、支付项目尾款

10、提供详细实验报告，完成实验项目

样品提交说明

1、实验所需的样品：

组织或者细胞：提供尽可能多的新鲜组织或细胞样品(包括3个技术重复)，样品量：组织样品不少于200 mg，细胞至少107­­ 个

RNA: 直接抽提好的的总RNA量大于5ug或者mRNA大于200ng( 注：OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)

DNA：总DNA大于5ug（OD260/OD280在1.7-1.9之间，完整性好）

2、提供尽可能详细的背景资料：样品来源、目的基因丰度等

3、引物、探针、标准品（可由客户自己提供，也可由公司直接设计提供）

结果交付

1、实验所需的试剂和仪器说明

2、RNA或DNA提取质量检测电泳图

3、定量检测原始数据（包括扩增曲线、溶解曲线）

4、详细的项目结题报告（包括实验报告和结果分析报告）

结果展示

相对定量—特异性引物融解曲线（单一峰）

绝对定量—标准品稀释梯度样品扩增曲线

qPCR和RNA-seq检测结果比较图

不同基因qPCR和RNA-Seq检测结果关联性分析

常见问题解答

1、绝对定量和相对定量有什么差异？

2、荧光定量PCR SYBR Green I法引物和TaqMan探针的设计原则分别是什么？
SYBR Green I法引物：
1）扩增产物长度在80-200 bp；引物应在核酸序列保守区内设计并有特异性；引物通常设计为跨内含子。
2）产物不能形成二级结构；引物长度在18-30 bp之间，其中碱基应随机分布；待扩增的片段Tm值应在55-65 ℃之间；待扩增的片段GC含量在40-60 %之间；引物自身及引物之间不能有连续4个碱基的互补。
3）引物5′端可进行修饰，3′端不能进行修饰； 引物3′端要避开密码子的第3位。
TaqMan探针：
TaqMan探针的设计原则为尽量靠近上游引物；长度一般为30-45bp，Tm 值至少比扩增引物高 5 ℃；5′端不能为 G，因为 G 会淬灭荧光，从而影响定量；设计时，需要通过软件来进行设计，网络上有许多免费的以及在线的设计软件可以使用。

3、判断扩增曲线是否良好的指标有哪些？
1）曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。
2）曲线指数期斜率与扩增率成正比，斜率越大扩增效率越高。
3）标准的基线平直或者略微下降，无明显的上扬趋势。
4）各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。
 
4、荧光定量PCR有哪些注意要点？
荧光定量PCR的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase free的操作，抽提的RNAOD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高，进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现。
除此之外，其他各个环节如试剂的稳定性，RNA反转的质量好坏，PCR上机条件的设定，加样的手法和熟练度等等也要注意。
 
 
参考文献
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001, 25:402–408.
Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky. PCR Applications: Protocols for Functional Genomics. Academic.
Shenglin Huang, et al. MicroRNA-181a modulates gene expression of zinc finger family members by directly targeting their coding regions. Nucleic Acids Research, 2010, 1-8.
Jianhua Xiong, et al. An estrogen receptor a suppressor, microRNA-22, is downregulated in estrogen receptor a-positive human breast cancer cell lines and clinical samples. The FEBS Journal 277 (2010) ,1684–1694.

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