什么是荧光定量PCR？

PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，无法对产物进行定性和定量分析。在PCR反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号的累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析，即为荧光定量PCR。

荧光定量PCR原理

扩增曲线

实时荧光PCR系统以扩增曲线图的方式输出结果，以PCR循环数和荧光强度来作图。扩增曲线是一个S形曲线，包括基线部分、指数增长区和平台期。

荧光阈值

• 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）

• 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

• 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光高值；进入指数期的初阶段

• 真正的信号:荧光信号超过阈值

CT值

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。反应中模板起始量越大，荧光信号达到阈值时所经过的循环数越少，即CT值越小。

常见荧光标记方法

非特异性荧光标记-SYBR Green I

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。

特异性荧光标记-TaqMan Probe

探针为一寡核苷酸， 5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。探针完整状态下无荧光。PCR扩增时探针被降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

荧光定量PCR技术的应用

相对定量

• 基因在不同样本中的表达差异

• 药物疗效考核

绝对定量

• 基因表达研究

• 转基因食品检测

• 环境微生物检测

病原体分析

• 病原体

等位基因分型

• SNP分析

• 等位基因点突变检测

实时荧光定量PCR采用两大工作平台，实现高效工作。

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