与传统的双酶切克隆类似，无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”T5核酸外切酶来产生的，它能沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。我们可以通过PCR的方法，在外源拼接片段的两端加上线性化载体的序列，在T5外切酶作用下，就能产生几乎一致的黏性末端。相同的黏性末端互补配对之后，借助DNA聚合酶进行修复添加缺失的碱基。最后一步借助Taq DNA连接酶，催化形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

1.不受片段序列的限制、实现任意组装。

传统的酶切克隆，会受到酶切位点的限制。而无缝克隆不依赖于限制性内切酶，仅需通过引物制作同源臂，只要一个试剂盒就可解决所有克隆实验。

2.同时无缝地拼接多个片段。

传统的酶切克隆，由于酶切位点限制，能组装的片段数量有限且在片段与片段之间产生“缝隙”。多片段拼接操作复杂，效率也较低。而无缝克隆可通过一步反应轻松拼接4-5个片段，可达10个。

3.节省时间，操作简便。

传统的酶切克隆，首先需要进行PCR，胶回收，然后酶切载体和外源片段，再纯化、连接、转化。如果需要进行多片段组装，还要花费更多时间。而无缝克隆仅需PCR和纯化或胶回收，随后即可直接进行一步多片段拼接。

    麦伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit 产品在30分钟内可以将一个或多个PCR扩增片段（平端）克隆插入任意载体的任意位置，室温孵育即可完成片段的连接，高效，准确，克隆阳性率可达95%以上。实验流程如下图：

1. 使用麦伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit进行单片段及多片段重组产物转化后，平板上均可产生较多单克隆，无插入片段的阴性对照版上几乎无克隆产生。